Los microorganismos ofrecen
diversos beneficios a la sociedad en diferentes formas. En otro aspecto son
también los microorganismos un vehículo para la producción de enfermedades, por
la producción de toxinas propiamente dichas o metabolitos tóxicos. Además de
daños en cultivos, descomposición de alimentos y enfermedades en animales. Es
por esto que el ser humano ha buscado los procedimientos necesarios para
destruir o controlar el crecimiento de los microorganismos perjudiciales.
DEFINICIONES IMPORTANTES:
1.- Muerte microbiana: Pérdida
irreversible de la capacidad de reproducirse. - Esterilización: Proveniente del
latín sterilis “incapaz de reproducirse”. Proceso por el cual las células
vivas, esporas viables, virus y viroides destruidos o eliminados de un objeto o
hábitat.
2.- Desinfección: Destrucción,
eliminación o inhibición de los microorganismos que pueden producir enfermedad
de una superficie u objeto. Se mantienen viables las esporas.
3.- Germicida: Terminación -cida
del latín que significa “destruir”. Es un agente que puede destruir
microorganismos patógenos y muchos no patógenos pero no necesariamente esporas.
(Bactericida, fungicida, viricida)
4.- Terminación _statico:
proveniente del griego statikos “que causa detención”, agente con capacidad de
inhibir el crecimiento microbiano, pero sin matarlos. (Bacteriostático,
fungistático)
Condiciones que influyen en la eficacia de un antimicrobiano
La destrucción de los
microorganismos y la inhibición del crecimiento no es un proceso simple, debido
a que la eficacia de un agente antimicrobiano es afectada por 6 factores:
1.- Tamaño de la población:
Debido a que la muerte es exponencial, una población muy grande requiere de
mayor tiempo.
2.- Composición de la población:
la eficiencia del antimicrobiano varía considerablemente con respecto a la
naturaleza de los organismos que son tratados porque su susceptibilidad es
distinta. Por ejemplo: las endosporas bacterianas son más resistentes que las
células vegetativas, las células jóvenes mueren con mayor facilidad y algunas
especies soportan mejor condiciones adversas.
3.- Concentración o intensidad
del agente antimicrobiano: A menudo, pero no siempre, entre mayor sea la
concentración del agente químico o más intenso agente físico, más rápidamente
se destruyen los microorganismos. Pero generalmente la eficiencia no está
relacionada con la concentración o intensidad. (alcohol)
4.- Tiempo de exposición: cuanto
más tiempo se exponga una población a un determinado agente, más organismos se
destruirán.
5.- Temperatura: A menudo, un
aumento en la temperatura aumenta la actividad de un agente químico.
6.- Entorno: la población que se
quiere destruir no se encuentra aislada, está rodeada de diversos factores
ambientales que pueden protegerla o facilitar su destrucción. Por ejemplo: el
calor es más efectivo en un medio ácido, la materia orgánica les da protección
contra el calor y los desinfectantes químicos.
Modo de acción de los antimicrobianos
1.- Alteración de la
permeabilidad de la membrana citoplasmática
2.- Daño a la pared celular o
inhibición de la síntesis de sus componentes
3.- Alteración del estado físico
químico de las proteínas y ácidos nucleicos, o inhiben su síntesis
4.- Inhibición enzimática
Procedimientos para el control microbiano
1.- Métodos físicos
2.- Métodos químicos
3.- Agentes Antimicrobianos
MÉTODOS FÍSICOS
Los métodos físicos se utilizan a
menudo para lograr la descontaminación, la desinfección y la esterilización
microbiana.
1.- CALOR: La exposición al agua
en ebullición durante 10 minutos es suficiente para destruir células
vegetativas, pero no es suficiente para destruir endosporas. No esteriliza. La
eficacia del calor como agente antimicrobiano, se puede expresar como el Tiempo
de muerte térmico (TMT), que se define como el tiempo más corto necesario para
destruir los microorganismos en una suspensión, a una temperatura específica y
en condiciones definidas. Sin embargo como la destrucción es logarítmica no es
posible eliminar completamente los microorganismos de una muestra.
Existen diversos métodos de
control de microorganismos por medio del calor:
a. Esterilización por vapor
(calor húmedo o autoclave): El agua es llevada a punto de ebullición de manera
que el vapor llena la cámara, desplazando el aire frío. Cuando todo el aire es
expulsado, se cierran las válvulas de seguridad y el vapor satura toda la
cámara, por lo que incrementa la presión, hasta que se alcanzan los valores
deseados (121°C y 15 lb presión). En estas condiciones se destruyen todas las
células vegetativas y endosporas en un tiempo que por lo general es de 15
minutos. Se piensa que el calor húmedo degrada los ácidos nucleicos,
desnaturaliza proteínas y además alterar las membranas celulares. Si no se
cumplen las condiciones adecuadas, no hay esterilización. Para controlar el
buen funcionamiento del equipo, se pueden incluir con la esterilización un
control biológico o un indicador químico. El indicador biológico consiste en
una ampolla estéril con un medio y un papel cubierto con esporas de Bacillus
stearothermophilus o Clostridium. Luego de la esterilización se rompe la
ampolla y se incuba por unos días. El indicador químico consiste en una cinta
especial con letras o líneas que cambian de color después del tratamiento
suficiente con calor.
b. Pasteurización: Se utiliza
para sustancias o medios que no pueden ser calentadas a más de su temperatura
de ebullición. Un calentamiento breve a 55 o 60°C destruirá los microorganismos
patógenos y disminuye los causantes de la descomposición de la sustancia. NO
esteriliza. Existen variaciones que son utilizadas en la industria de la leche:
la pasteurización rápida (HTST high temperature short-term) que consiste en
calentar a 72°C por 15 segundos. Y la pasteurización a temperatura ultra
elevada (UTH ultrahigh temperature) que calienta a 140-150°C por 1 a 3
segundos.
c. Tindalización o esterilización
fraccionada al vapor: se utiliza para químicos o material biológico que no
puede llevarse a más de 100°C. Se calienta a una temperatura de 90°C a 100°C
durante 30 minutos por tres días consecutivos y se incuba a 37°C entra cada
calentamiento. El primer calentamiento destruye células vegetativas pero no
esporas, por lo que germinan a 37ºC y luego son eliminadas con el siguiente
calentamiento.
d. Calor seco: Se utilizan hornos
o estufas a una temperatura de 160-170°C por 2 o 3 horas. Es menos efectivo que
el calor húmedo, pero no corroe utensilios metálicos. Es lenta y no se puede
utilizar para material termo sensible.
e. Incineración: Destruye por
completo los microorganismos. (calentar las asas en los mecheros).
f. Temperaturas bajas:
Refrigeración y congelación, son únicamente bacteriostáticos. En general, el
metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0° C.
Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden
conservarlos durante largos períodos de tiempo. Esta circunstancia es
aprovechada también por los microbiólogos para conservar los microorganismos
indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70°
C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.
g. Desecación: Es de efecto
bacteriostático y las esporas permanecen viables.
2.- FILTRACIÓN: es utilizada para
materiales termosensibles.
a. Filtros de profundidad: Se
utilizan materiales fibrosos o granulados que forman una capa gruesa con
canales de diámetro muy pequeño. La solución es aspirada al vacío y los
microorganismos quedan retenidos o son adsorbidos por el material. Se utilizan
diatomeas, porcelana no vidriada, asbestos.
b. Filtros de membrana: Son
circulares con un grosor de 0.1 mm y con poros muy pequeños, de unos 2 μm por
lo que los microorganismos no pueden atravesarlo. Se fabrican de acetato de
celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilo u otros materiales sintéticos.
3.- RADIACIÓN:
a. Ultravioleta: Es letal para
todas las clases de microorganismos por su longitud de onda corta y su alta
energía. Es letal a 260 nm ya que es la longitud de onda que es más
efectivamente absorbida por el ADN. El mecanismo primario del daño al ADN es la
formación de dímeros de timina lo que inhibe su función y replicación. Son
escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.
b. Ionizante: Niveles bajos
pueden producir mutaciones e indirectamente resultar en la muerte, niveles
altos son letales. Específicamente causan una serie de cambios en las células:
ruptura de puentes de hidrógeno, oxidación de dobles enlaces, destrucción de
anillos, polimerización de algunas moléculas, generación de radicales libres.
La mayor causa de muerte es la destrucción del ADN. Es excelente esterilizante
y con penetración profunda en distintos materiales, por lo que se utilizan para
esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas desechables,
sondas, etc. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas
porque producen alteraciones de los componentes.
MÉTODOS QUÍMICOS
Condiciones ideales para un
agente antimicrobiano químico:
1.- No tóxico para el ser humano,
animales ni medio ambiente
2. - Actividad antimicrobiana
3.- No debe de reaccionar con la
materia orgánica o corroer
4.- Estable y homogéneo
Modo de acción:
1.- Bacteriostáticos: Inhibidores
de síntesis proteica por unión al ribosoma, que es reversible, pues se disocia
de este cuando disminuye en concentración.
2.- Bactericidas: Causa la muerte
celular pero no la lisis. No se eliminan por dilución.
3.- Bacteriolíticos: Inducen la
lisis celular al inhibir la síntesis de la pared celular o dañan la membrana
citoplasmática.
Agentes antimicrobianos químicos:
a. Fenoles: El primer
desinfectante y antiséptico utilizado, en 1867 Joseph Lister los empleó para
reducir el riesgo de infección en las cirugías. Hasta ahora los fenoles y sus
derivados (cresol, xilenol) son utilizados como desinfectantes en laboratorios
y hospitales. Elimina micobacterias, eficaz aún en presencia de materia
orgánica y permanece activo en la superficie después de mucho tiempo de su
aplicación. Desnaturaliza proteínas y altera la membrana. Tiene olor
desagradable y puede producir irritaciones cutáneas.
b. Alcoholes: No elimina esporas
pero son bactericidas y fungicidas y algunas veces viricida (virus que contienen
lípidos), son comúnmente utilizados principalmente el etanol y el isopropanol
en concentraciones de 70-80%. Tienen el mismo modo de acción de los fenoles.
c. Metales pesados: mercurio,
arsénico, plata, zinc y cobre. Son bacteriostáticos ya que el metal se combina
con los grupos sulfihidrilos de las proteínas inactivándolas o precipitándolas.
Son tóxicos. Ejemplos: sulfato de cobre (alguicida) y nitrato de plata
(gonorrea oftálmica en niños)
d. Halógenos: - Yodo: antiséptico
cutáneo. Oxida componentes celulares y forma complejos con las proteínas. En
altas concentraciones puede destruir algunas esporas. Puede lesionar la piel,
dejar manchas y desarrollar alergias.
- Cloro: oxida componentes
celulares, requiere un tiempo de exposición de unos 30 minutos. El producto
clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio, que es activo
sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un
amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio
se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el
hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ión hipocloroso es
muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fácilmente en la
célula a través de la membrana citoplasmática. En cambio, el ácido hipocloroso
es neutro y penetra fácilmente en la célula, mientras que el Cl2 ingresa como
gas. Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica, pues
puede haber en el medio sustancias capaces de reaccionar con los compuestos
clorados que disminuyan la concentración efectiva de éstos.
e. Compuestos cuaternarios de
amonio (detergentes): Moléculas orgánicas emulsificantes porque contienen
extremos polares y no polares, solubilizan residuos insolubles y son agentes
limpiadores eficaces. Solo los catiónicos son desinfectantes, alteran membrana
y pueden desnaturalizar proteínas. No destruyen micobacterias ni esporas. Se
inactivan con el agua dura y el jabón.
f. Aldehídos: Formaldehído y
glutaraldehído, se combinan con las proteínas y las inactivan. Eliminan esporas
(tras 12 horas de exposición) y pueden usarse como agentes esterilizantes.
g. Gases esterilizantes:
Esterilización de objetos termosensibles.
- Oxido de etileno: microbicida y
esporicida, se combina con las proteínas celulares. Alto poder penetrante. En
concentraciones de 10-20% mezclado con CO2 o diclorodifluorometano. Se debe de
airear ampliamente los materiales esterilizados para eliminar el gas residual
porque es muy tóxico.
AGENTES ANTIMICROBIANOS
La medicina moderna depende de
los agentes quimioterapeuticos para el tratamiento de enfermedades. Estos
agentes destruyen a los microorganismos patógenos o inhiben su crecimiento para
evitar un daño significativo al hospedador. La mayoría de estos agentes son
antibióticos derivados de productos microbianos o sus derivados. Existen
también antibióticos sintéticos.
Características de los agentes
antimicrobianos:
1.- Toxicidad selectiva: debe de
eliminar o inhibir exclusivamente el microorganismo patógeno que está dañando
al hospedador.
2.- No causar efectos adversos:
No deben de causar efectos indeseables para el hospedador. (respuestas
alérgicas, daño renal, daño gastrointestinal, nauseas, depleción de la médula
ósea)
3.- Espectro de acción: Algunos
agentes tienen un espectro de acción estrecho por lo que su efecto es contra
una limitada variedad de microorganismos. Otros tienen un espectro de acción
amplio, y pueden atacar diferentes clases de patógenos.
Para tener una idea de la
efectividad de un agente antimicrobiano puede obtenerse:
1.- Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI), que es la mínima concentración del agente antimicrobiano que
puede inhibir el crecimiento de un patógeno en particular.
2.- Concentración Letal Mínima
(CLM), es la mínima concentración de un agente antimicrobiano que mata a un
patógeno.
Mecanismos de acción de los
agentes antimicrobianos: Las drogas antimicrobianas pueden causar un daño al
organismo patógeno de varias maneras:
1.- Los antibióticos más
selectivos son aquellos que interfieren con la síntesis de la pared bacteriana.
(penicilinas, vancomicina, bacitracina, cefalosporinas).
2.- Pueden inhibir la síntesis
proteica al unirse al ribosoma procariótico. (estreptomicina, gentamicina,
cloranfenicol, eritromicina)
3.- Inhibición de la síntesis de
ácidos nucleicos, inhibiendo la ADN girasa, interfiriendo con la replicación,
transcripción o traducción, bloqueando la síntesis de ARN, etc.
(ciprofloxacina, quinolonas, rifampicina) - Daño en la membrana plasmática
uniéndose a ella para dañar su estructura y alterar su permeabilidad.
(polimixina B)
4.- Algunas drogas
antimicrobianas pueden actuar como antimetabolitos: bloquean las vías
metabólicas por competición inhibitoria. Compiten por los metabolitos.
Determinación del nivel de
actividad antimicrobiana
Existen diversos métodos para
determinar la actividad de los agentes antimicrobianos, entre ellos tenemos:
Test de susceptibilidad por dilución: Se utiliza para determinar la CMI y la
CLM. Es un método de dilución en caldo, en donde se colocan concentraciones
decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos
con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo. El
caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton
suplementado con los cationes magnesio y calcio. Un tubo de caldo se mantiene
sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la incubación
adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los
tubos que indicará desarrollo bacteriano.
El microorganismo crecerá en el
tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente
antirnicrobiano como para inhibir su desarrollo. La concentración de
antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de
turbidez (igualando al control negativo), se designa como la CMI. Para medir la
CLM se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo
sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad. Una vez
determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de
los tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de agar (la pequeña
cantidad del agente antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se
elimina por dilución en el agar), y el número de colonias que crece en estos
subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de
UFC/ml del cultivo original.
Dado que incluso las drogas
bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana, la
mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos
de 0,1 % del inóculo original se denomina CLM. Prueba de Difusión en agar: El
microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar
Müller-Hinton y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a
varios antibióticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC y al cabo
de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la
zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se compara con las
referencias oportunas publicadas por el NCCLS. Con esta referencia podemos
informar si el micoorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a
cada uno de los antibióticos ensayados en las placas.
Método de E-test: Se trata de una
técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en
µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones
crecientes de antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia
tira. El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se
deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la incubación
de 16-24 horas a 35ºC se observan las placas y se valora la zona de inbición,
de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente
observando el punto más bajo de la elipse que presente crecimiento.
Pruebas automatizadas: La mayoría
de estos novedosos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido
sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento
bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador
(mediciones por turbidez o fluorescencia). Su manipulación suele ser fácil y
rápida, generalmente automatizada o semiautomatizada, lo que los convierte en
métodos ideales para grandes volúmenes de trabajo. Una de sus grandes limitaciones
es que sólo ofrecen garantía para investigar microorganismos de crecimiento
rápido y que no tengan requerimientos especiales.
Resistencia a los
antimicrobianos: La resistencia los antimicrobianos es uno de los mayores
problemas, se define como la capacidad adquirida de un organismo para resistir
los efectos de un agente quimioterapeutico al que habitualmente es sensible. La
mayor parte de la resitencia es debida a genes de resistencia que se tranfieren
por intercambio genético.
Algunos microorganismos pueden
ser naturalmente resistentes a algunos antibióticos y existen diversas razones:
1.- El organismo puede carecer de
la estructura que inhibe el antibiótico (carencia de pared celular).
2.- El organismo puede ser
impermeable al antibiótico.
3.- El organismo puede alterar el
antibiótico inactivándolo.
4.- El organismo puede modificar
la estructura a la que es dirigido el antibiótico.
5.- Por un cambio genético, se
pueden producir vías metabólicas que bloqueen el antimicrobiano.
6.- El organismo puede ser capaz
de bombear hacia fuera el antibiótico que haya entrado a la célula.
Otras veces, la resistencia
involucra otra serie de causas:
1.- Tratamientos incompletos
(selección de cepas resistentes)
2.- Uso indiscriminado de
antibióticos (flora normal resistente)
3.- Transferencia de genes de
resistencia entre poblaciones bacterianas.
Se cual sea el mecanismo, esta
resistencia está genéticamente codificada en el cromosoma o en plásmidos
(plásmidos de resistencia).
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